5.DNA序列分析：在DGGE分析中检出p53变异条带的样本需进一步进行DNA序列分析。大约100 ng纯化后的PCR片断被作为模板加到20 μl DNA序列分析反应液中(Perkin Elmer, USA)，反应液含3.2×10-12 mol/L和DGGE同样的引物。分别经95℃ 30秒，50℃ 15秒，60℃ 4分钟25个周期处理后，酒精沉淀产物，沉淀物再被溶解于25 μl的template suppression reagent (Perkin Elmer)内，在ABI PRISMTM310自动基因序列分析仪中分析。每一样本均分别进行正向和反向两个方向的检测。当一个肿瘤标本有一个以上的p53变异时，需再重复一次全部反应过程(包括DNA扩增，PCR片断的提纯以及序列分析)，以排除假阳性。

　　6.p53免疫组化染色：石蜡切片脱蜡至水化，微波炉处理5分钟后，用ABC法染色(p53单克隆抗体为DO-7，1∶500稀释)，DAB显色，苏木素复染，于普通显微镜下观察。阳性核染色的细胞＞5%者，被视为阳性［1］。

　　7.统计学处理：用t检验检测变异碱基峰/正常峰在原发灶和转移灶的比值。p53变异与p53过度表达相关性的检测以Chisquare检测法处理。P值＞0.05者为差异有显著性。

　　结　果

　　1.p53变异分析：DGGE和序列分析结果见图1。在34例受检患者中，2例PCR失败。剩余32例中，19例(59.4%)在p53外显子5～9发现变异，其中14例显示大肠原发灶和肝转移灶为相同的变异，5例显示p53变异仅发生于肝转移组织；另有2例原发灶即有p53变异的患者，在转移灶除保留原有变异外，还出现了新增加的变异(表2)。在原发、转移灶共37处p53变异中，73.0%(27/37)是错义突变，16.2(6/37)为无义突变，4处插入突变。在所有点变异中，主要为G→A和C→T碱基转换，只有6例为碱基颠换。

1：野生型p53；2：大肠标本，可见p53变异的条带；3：肝转移标本，可见加深的p53变异的条带

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