材料和方法

　　1.肿瘤组织标本：收集大肠癌根治性切除术后5个月～5年内，因肝转移接受肝切除术患者的大肠原发灶及肝转移灶石蜡标本共34例。全部标本的组织定性均为大肠腺癌，其肿瘤细胞含量＞90%。

　　2.DNA提取：石蜡切片首先脱蜡至水化，然后经蛋白酶K/SDS TE缓冲液在48℃下消化48小时，再经饱和酚/氯仿抽提，最后以3 mol/L的醋酸钠(pH5.2)和2倍体积的95%乙醇沉淀DNA。在紫外分光光度计下测吸光度A 260/A 280(曾称光密度OD)，二者比值通常在1.7～1.8。合格的DNA样品保存于-70℃下。

　　3.PCR：DNA样品首先在94℃处理4分钟，以灭活蛋白酶。PCR扩增条件为95℃ 30秒→58℃ 30秒→72℃ 90秒，共35个循环。最后经过72℃ 7分钟“延伸”步骤，进入4℃程序下保存。PCR产物经2.7%琼脂电泳确认为单一条带者为合格。为便于DGGE分析，在每一对引物的正向引物5′端加有一个28 bp长的GC-rich序列(表1)。

表1　p53引物及DGGE电泳条件

外显子	引物序列	PCR片段 大小	DGGE
			变性剂浓度(%)	电泳时间(h)
5	Forward 5′(GC)*CTC TTC CTG CAG TAC TCC CCT GC-3′	239	50～80	3～4
	Reverse 5′-GCC CCA GCT GCT CAC CAT CGC TA-3′
6	Forward 5′(GC)GAT TGC TCT TAG GTC TGG CCC CTC-3′	213	40～70	6～8
	Reverse 5′-GGC CAC TGA CAA CCA CCC TTA ACC-3′
7	Forward 5′(GC)GTG TTG TCT CCT AGG TTG GCT CTG-3′	167	40～70	7～8
	Reverse 5′-CAA GTG GCT CCT GAC CTG GAG TC-3′
8	Forward 5′(GC)ACCTGATTTCCT TACTGCCTCTGG C-3′	228	35～65	4～6
	Reverse 5′-GTC CTG CTT GCT TAC CTC GCT TAG T-3′
9	Forward 5′(GC)GCC TCT TTC CTA GCA CTG CCC AAC-3′	130	20～60	4～5
	Reverse 5′-CCC AAG ACT TAG TAC CTG AAG GGT G-3′

　　* (GC)=5′-CGCCCGCCGCGGCCCGCCGCCCCGCCCG-3′　　4.DGGE：DGGE按照文献［3，4］所述方法进行。首先利用垂直型DGGE，确定每一外显子的最适变性剂浓度范围。然后通过平行DGGE进行样品检测，电泳时的温度为56℃，电压为150 V，所需时间依外显子的不同而不同(表1)。电泳后，胶板经3 μg/ml的溴化乙啶染色20分钟，在紫外灯透照器上观察并摄像。

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