大肠癌为我国常见恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。但其总的治疗效果仍不理想，复发和死亡屡有所见。因此如何提高治疗效果乃当务之急。随着分子生物学理论和技术的发展，对大肠癌基因突变和表达的研究也日益广泛和深入。p53基因突变被认为是腺瘤-腺癌序列演变中的一个重要因素，并具有预后意义。本文通过对大肠癌标本的检测结合病理和临床资料探讨大肠癌p53基因突变的临床意义及其对预后的价值。

　　材料与方法

　　自1996年3月～1997年3月，作者随机对手术切除的大肠癌69例标本，取癌灶组织和肿瘤远切端正常大肠粘膜组织，置-80℃中保存，用PCR-SSCP法检测p53基因第5～8外显子的突变情况。病变属Dukes′A期2例，B期35例，C期18例和D期14例。大肠癌细胞分化中， Broder Ⅰ级4例，Ⅱ级60例，Ⅲ级2例，Ⅳ级3例；肿瘤大体类型：增生型21例，溃疡型32例，浸润型16例。每例均取直径1 cm大小的癌组织一块，制备匀浆，另取正常人外周血白细胞及正常肠粘膜组织按常规法提取DNA并配制成终末浓度为0.1 μg/μl的应用液-20 ℃保存。

　　PCR-SSCP检测p53基因第5～8外显子突变情况。PCR扩增：PCR反应体系为50 μl，其余各组分参照文献，p53基因点突变主要发生在外显子5、6、7、8中，四对引物设计参见文献［1～3］，引物序列及反应条件如表1所示。SSCP分析：取10 μl PCR反应产物，加入等体积95%甲酰胺染料(20 mmol/L EDTA，0.1%溴酚兰)，95℃保温7 min后立即置于冰浴中7 min。用8%聚丙烯酰胺凝胶(acrylamide∶bisacrylamide=49∶1)，4℃条件下电泳3 h(缓冲液：0.5×TBE，pH 8.0)，直至溴酚兰接近凝胶底部为止。凝胶用硝酸银染色；在甲醇∶水∶冰乙酸(5∶1∶4)混合液中固定0.5 h，3.4 mmol/L重铬酸钾、3.2 mmol/L硝酸混合液中氧化10 min×2次，蒸馏水中漂洗2 min×4次，12 mmol/L硝酸银中染色30 min，蒸馏水漂洗5 min，在0.28 mol/L碳酸钾，0.03%甲醛中显色至条带清晰，10%乙醇-5%醋酸中定色5～10 min；结果判断：通过与对照样品的条带比较，判断待析样品是否有突变存在，与对照条带有不同者存在突变，完全相同者则无突变(见表1)。

表1　用于p53基因突变检测的PCR引物及扩增条件

扩增的外显子	扩增片段长度(bp)	引物序列(5′～3′)	扩　增　条　件
5	183	TACTCCCCTGCCCCTCAACAAG	热变性　35×
		ATCGCTATCTGAGCAGCGCTC	94℃ 1 min，55℃ 1 min,72℃ 1 min
6	114	GGTCTGGCCCCTCCTCAGCAT	热变性　35×
		CTCAGGCGGCTCATAGGGCAC	94℃ 1 min，63℃ 1 min,72℃ 1 min
7	111	GTTGGCTCTGACTGTACCACC	热变性　35×
		CCTGGAGTCTTCCAGTGTGAT	94℃ 1 min，55℃ 1 min,72℃ 1 min
8	135	TGGTAATCTACTGGGACGGAA	热变性　35×
		TCGCTTAGTGCTCCCTGGGGG	94℃ 1 min，55℃ 1 min,72℃ 1 min

　　统计学处理　表2中关于p53基因突变与Dukes′分期关系的统计方法，选用t检验进行统计处理。对于Dukes′D期突变组与未突变组生存期的统计，选用Kaplan-Meier生存分析法进行统计。

表2　病灶组织与正常组织p53基因突变与Dukes′分期的关系

	A	B	C1	C2	D	合计
Ca(+)N(+)	0	8	2	1	2	13
Ca(+)N(-)	1	9	6	0	7	23
Ca(-)N(-)	1	18	9	0	5	33
总计	2	35	17	1	14	69

　　注：Ca为病灶组织　N为正常组织　(+)为p53基因突变　(-)为p53基因未突变(P＞0.05)

　　结果

　　69例大肠癌标本中，36例p53基因突变，突变率为52.17%，其中第5外显子突变32例，占88.89%，第5、6外显子双突变1例，第6外显子突变1例，第7和8外显子各突变1例。附图显示部分标本p53基因第5外显子扩增产物SSCP分析结果。36例p53基因突变阳性的病例中，癌组织和远切端正常粘膜均示突变阳性者13例，占36.11%(13/36)。病灶组织与正常组织p53基因突变与Dukes′分期关系见表2，经统计学分析，p53基因突变与Dukes′分期无明显相关性(P＞0.05)。由于随访时间较短，本文仅对Dukes′D期的14例患者进行了2～12月的随访，结果发现p53基因未突变的5例中2例死亡，死亡率40%，2例死亡患者生存期均小于5个月，5例患者平均生存期为7.2月。而p53突变的9例中7例死亡(其中2例癌灶组织、正常组织突变者均已死亡，7例癌灶组织突变、正常组织未突变的患者中，5例死亡)，死亡率77.8%，7例死亡患者生存期均小于4个月，9例患者平均生存期为4.8月，Dukes′D期突变组与未突变组，经统计学处理后，生存期有显著差异(P=0.041)。

附图　部分标本p53基因外显子5 PCR-SSCP分析结果

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