2.细胞周期调控因子表达检测：采用SP法，分别进行Cyclin d1(1∶40)、P16、P21(1∶40)、Rb (1∶30)、P53和PCNA(1∶100)免疫组化染色，DAB显色。染色结果根据阳性细胞染色强度及其所占视野面积的百分比分别记为：(-)：无阳性细胞；(+)：阳性细胞面积＜25%，呈棕色；(++)：阳性细胞面积≥25%，呈深棕色。PCNA染色采用计数标记指数(labeling index，LI)，即每100个细胞中的PCNA阳性细胞数。

　　3.MSI检测：(1)DNA提取：将冰冻新鲜组织和石蜡组织连续切片10～15张，厚度5μm，参照Zhuang等［3］报道的微切割技术，收集大肠癌及正常粘膜组织。采用蛋白酶K消化、苯酚/氯仿抽提法提取基因组DNA。(2)寡核苷酸引物：由中国科学院上海细胞学研究所合成。碱基序列为：D18S34(5′-CAG aAA ATT CTC CTG GCT A-3′，5′-CTC ATG TTC CTG GCA AGA AT-3′)；D17S799(5′-ATT gCC AGC CGT CAG TT-3′，5′GAC CAG CAT ATC ATT ATA GAC AA-3′)；D5S409(5′-GAA gGG ATG AAG TGT GGA TT-3′，5′-TCA AGG ACT GTA GGA TGG CA-3′)；TCF-2(5′-GAC CCC ACA GCC TAT TCA GA-3′，5′-TTG ACT GCT GAA CGG CTG CA-3′ )；P53(5′-AGG GAT ACT ATT CAG CCC GAG GTG-3，5′-ACT GCC ACT CCT TGC CCC ATT c-3′ )和Rb(5′-CCT ATC TCC GGC TAA ATA C-3′，5′-AAT TAA CAA GGT GTG GTG g-3′)。(3)PCR扩增与分析：采用美国产2400型PCR仪扩增，反应总体积为20μl，根据引物不同设定循环参数，分别为94℃，40 s～1 min；52℃～56℃，40 s～1 min；72℃，1～2 min。共35～40次循环。取PCR反应产物10 μl加入10%变性聚丙烯酰胺凝胶孔中，电泳条件除Rb为250 v，5 h外，其余均为100 V，5 h。取下凝胶行银染显色。结果判定：每例标本中，肿瘤组织与其相对应的正常组织相比，出现额外的DNA等位片段或等位片段出现缺失即为MSI阳性。

　　4.统计学处理：采用χ2检验和单因素方差分析。

　　结果

　　1.大肠癌组织中细胞周期调控因子表达和MSI的发生频率：5种细胞周期调控因子在56例大肠癌中呈不同程度的表达，其阳性率分别为Cyclin d1 57.1%(32/56)、P16 37.5%(21/56)、P21 64.3%(36/56)、P53 42.9% (24/56)和Rb85.7%(48/56)。其中Cyclin D1、P21、P53以细胞核着色为主，P16主要呈胞浆染色，Rb多呈胞浆和胞核阳性。

　　分化管披肝沥胆癌,癌组织Cyclin d1蛋白呈强阳性表达,癌旁粘膜呈阴性 SP染色 ×200 图2粘液腺癌p16蛋白主要呈细胞浆阳性表达 SP染色 ×200

　　56例大肠癌中各微卫星位点MSI检出率分别为D18S3425.0% (14/56)、D17S799 21.4%(12/56)、D5S409 16.1%(9/56)、TCF-2 21.4%(12/56)、Rb17.9%(10/56)和P53 23.2%(13/56)。综合以上6个位点分析，56例大肠癌共检出MSI25例，MSI总发生率为44.6%，其中仅1个微卫星位点发生MSI 7例，≥2个位点发生MSI18例，占32.1%。

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