1.3.2 交叉反应性试验 以pG1, pG2, p24, HBcAg, HCV核心区(C区)和非结构区NS-3区, 以及大肠杆菌提取蛋白分别包被聚苯乙烯板, 以间接ELISA法测定5株McAb的交叉反应性。

1.3.3 McAb的效价测定及IgG亚类鉴定 以间接ELISA法测定5株杂交瘤细胞培养上清和腹水的抗体效价,由第四军医大学免疫学教研室协助完成。 小鼠Ig亚类ELISA试剂盒为Gibco公司产品。

1.3.4 McAb作用表位的鉴定 5株McAb腹水经protein-A亲和层析柱纯化, 改良的过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP)。 以pG1抗原2 mg/L包被聚苯乙烯板, 将浓度为400 mg/L的5株未标记McAb作10倍连续稀释后,与5株相同的HRP-McAb逐一配对等量混合, 加入ELISA板(100 μl/孔)。 37℃温育1 h后洗涤3次, 加OPD底物液显色10 min, 以1 mol/L的H２SO4终止反应, 测OD490 nm值。 作竞争抑制曲线判定5株McAb的作用表位。

1.4 双抗体夹心法的建立

1.4.1 方法建立 根据表位测定结果, 选择针对p24上不同表位的两株McAb, 以2G10为包被抗体, HRP标记的3H5作为酶标记McAb, 建立夹心ELISA法: 即以McAb 2G10(10 mg/L)包被聚苯乙烯板, 4℃过夜, 洗涤3次后加2%BSA封闭液进行封闭(4℃ 8 h)。 甩干封闭液, 干燥后真空封装保存于4℃。 使用时加入标准品和待检HIV抗体阳性血清(100 μl/孔), 37℃水浴温育1 h, 洗涤3次加入HRP-3H5 37℃水浴继续温育1 h, 洗涤5次后拍干, 加入OPD底物液, 37℃显色10 min后, 以1 mol/L H2SO4终止反应, 测定OD490值。

1.4.2 灵敏度测定 将纯化的p24抗原做倍比稀释, 测定本法的检测

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